茶源天然小分子化合物新靶点的发现

理学院“云南省茶因子与功效研究创新团队”围绕茶源表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和咖啡因等天然小分子化合物作用靶点的发现开展了系列的研究工作。

茶叶的化学成分

一、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）靶向Notch促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合

糖尿病作为一种综合性代谢疾病，其发病率呈现逐年升高的趋势，我国糖尿病患者总人数达１亿且不断快速增长，是世界上糖尿病患病人数最多的国家。在糖尿病的诸多并发症中，糖尿病患者伤口愈合能力受损是糖尿病典型的并发症，如果慢性的损伤和溃疡发生在足部，则有可能引发糖尿病足，部分患者最终需截肢治疗，给家庭、社会带来沉重的经济负担。糖尿病患者伤口愈合障碍严重影响人们的日常生活,有效地预防和治疗糖尿病伤口愈合障碍具有重要的临床意义。

研究人员利用生物分子相互作用技术、细胞模型和动物模型系统研究并阐明了茶叶中EGCG通过靶向Notch促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的作用及其机理。结果显示，EGCG能够显著抑制糖尿病小鼠伤口皮肤中Notch信号通路、巨噬细胞积累和炎症反应，且证明了这种作用是EGCG通过与Notch1蛋白直接结合发挥的。

评估了EGCG对糖尿病伤口愈合的作用。在糖尿病小鼠伤口模型上，通过EGCG在伤口组织上的连续涂抹，在增殖期可以观察到明显的促进糖尿病小鼠伤口愈合的作用，EGCG处理组小鼠的伤口愈合率较模型组提高约为18%，接近正常组小鼠愈合率。皮肤伤口组织样品的再上皮化和胶原蛋白沉积检测同样确定了EGCG对增殖期伤口愈合的促进作用，其EGCG处理以后，糖尿病小鼠的再上皮化提高了约10%；胶原蛋白的沉积增加了2%，恢复到与正常小鼠相当的水平。

证实了EGCG与Notch结合，减弱Notch的表达和激活，进而减弱糖尿病小鼠皮肤伤口组织中的巨噬细胞的炎症反应和炎症因子水平，降低炎症是EGCG促进增殖期糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的主要机制。

创新性成果、科学意义和水平：该研究详细地阐述了EGCG促进糖尿病伤口愈合的功效和作用机理，为EGCG作为治疗糖尿病伤口愈合的药物开发提供了理论依据。研究成果发表于《美国实验生物学联合会会刊》（The FASEB Journal），EGCG促进糖尿病伤口愈合作用及其机理的阐明，是我国在茶叶功效研究领域的重大突破，为糖尿病伤口愈合的治疗提供了新的可能。

二、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）靶向Notch受体快速缓解炎症的分子机制

炎症是糖尿病、肿瘤、心血管疾病等多种疾病的诱发或促进因素。茶叶中的EGCG有降低炎症反应的效果。国外报告EGCG通过层粘连蛋白受体67LR发挥抑制炎症效应。该成果采用THP-1细胞分化形成的巨噬细胞为炎症细胞，用脂多糖（LPS）处理建立炎症反应模型，考察在极短时间内EGCG对炎症调节的作用机制。发现EGCG在早期即可显著降低LPS激发的炎症反应。且EGCG早期的炎症调节效应不依赖于早先发现的EGCG受体67LR。EGCG在30-90分钟内没有降低LPS引起的NF-κB磷酸化。EGCG降低炎症效应可能不通过NF-κB、MAPK。EGCG处理细胞后的30-90分钟，Notch1-2发生了显著的降解。EGCG对Notch的作用不依赖于LPS。EGCG处理能够在极短时间内导致细胞膜表面成熟Notch的大幅减少,细胞核内Notch活化产物NICD快速降解，表现出关闭Notch信号效应。EGCG对Notch效应呈剂量依赖性，并在短至2分钟内即已出现，对Notch靶基因的表达也呈现出类似效应，且不依赖于67LR。通过RNAi降低Notch1、Notch2的表达，以THP-1/siNotch1、THP-1/siNotch2分化成的巨噬细胞为模型，表明Notch1/2对于EGCG调节炎症效应是必要的。采用人原代巨噬细胞检测EGCG对炎症的效应及对Notch的作用，效应与THP-类似。分子互作实验证实EGCG与Notch活化负调节结构域以中等亲和力结合。

创新性成果、科学意义和水平：该研究成果EGCG快速抑制炎症的Notch受体，发表在以“(-)-Epigallocatechin Gallate Targets Notch to Attenuate the Inflammatory Response in the Immediate Early Stage in Human Macrophages”为题发表在Front. Immunol.上，被新华网、搜狐网、云南网、BioArt公众号等广为报道，他引33次。

三、氧化型茶多酚抑制RAW 264.7细胞中的RANK信号通路来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成

在绿茶中，（-）-epigallocatechin-3-gallate（EGCG）是最丰富，最有活性的化合物，已被证明可以抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。考虑到EGCG的高度可氧化性和不稳定性，我们假设EGCG氧化产物比EGCG具有更大的抗破骨作用。在这项研究中，我们使用化学氧化策略成功分离并鉴定了EGCG氧化衍生物（-）-没食子儿茶素没食子酸酯（化合物2）。然后，我们比较了化合物2和EGCG在RAW 264.7细胞中抑制RANKL诱导的破骨细胞生成的能力。TRAP染色和F-肌动蛋白环免疫荧光染色的结果表明，与EGCG相比，化合物2对RANKL诱导的破骨细胞分化和F-肌动蛋白环形成的抑制作用更强。此外，实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹分析表明，化合物2显著且更强烈地抑制了与破骨细胞生成相关的标记基因和蛋白质的表达，包括c-Src，TRAP，组织蛋白酶K，β3-整合素，和MMP-9，与EGCG相比。此外，化合物2比EGCG更明显地抑制了RANKL诱导的破骨细胞形成的主要转录调节因子NFATc1和c-Fos的表达。从机理上讲，分子相互作用试验表明化合物2以高亲和力（KD = 189 nM）与RANK结合并阻断RANKL-RANK相互作用，从而抑制破骨细胞前体中RANKL诱导的早期RANK信号通路，包括p65，JNK，ERK和p38。综上所述，这项研究首次证明了EGCG的氧化衍生物（化合物2）通过抑制RAW 264.7细胞中的RANK信号通路来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。

创新性成果、科学意义和水平：喝茶对骨骼系统有积极作用，主要通过抑制破骨细胞生成，预防绝经后骨质疏松。发现了氧化型茶多酚具有比EGCG更大的抗破骨作用。以“Oxidation derivative of (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis by suppressing RANK signaling pathways in RAW 264.7 cells.”为题发表在Biomed. Pharmacother.上。

四、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的结构改造及靶向EGFR缓解非小细胞肺癌

茶多酚是茶叶中特有的主要特征活性成分，其主要由表儿茶素（(-)-epicatechin, EC）、表没食子儿茶素（(-)-epigallocatechin, EGC）、表儿茶素没食子酸酯（(-)-epicatechin-3-gallate, ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin-3-gallate, EGCG）组成。其中EGCG占儿茶素的50-70%，不仅含量最高，且大量研究表明EGCG是绿茶多酚中抗肿瘤活性最强的一种。EGCG的分子结构中具有多个活性部位和反应活性基团，因此可以发生多种化学反应；吡喃环的醚键结构不稳定，在酸碱性或酶的作用下发生变化。EGCG的这些结构特点决定了其具有一定的局限性，如稳定性差、生物利用度低等。因此，研究了EGCG的氧化产物和EGCG的结构修饰与改造。

创新性成果、科学意义和水平：通过研究揭示了EGCG氧化物、EGCG衍生的生物学功能；总结了EGCG氧化物及其修饰物具有抗肿瘤、降血糖、治疗骨质疏松等功效，整理EGCG的构效关系：（1）EGCG结构A环5,7位上羟基取代活性高于甲氧基取代；（2）C环和D环之间的酯键连接是必不可少；（3）改变C环和D环之间连接链的长度可以提高活性；（4）对B环结构的破坏是不利的；（5）B环和D环之间立体化学构型相同；（6）用4-乙酰氧基-3-(3-甲基丁基-2-烯-1-基)苯甲酸代替没食子酸可以提高抑制活性（图7）。根据EGCG衍生物结构，几乎都保留C环和D环之间的酯键结构，而酯键是EGCG结构不稳定的一个重要因素。相关研究成果发表于Fron. Chem., Bioorg. Med. Chem. Lett., RSC Adv.等SCI收录杂志16篇，申请国家发明专利2项。

五、发现了咖啡因抗氧化和抗肾癌的两个新靶点，揭示了咖啡因的健康功能

咖啡因是茶叶的特征性化学成分，具有醒神、抗氧化、抗炎症、降血糖以及抗癌等多种健康功能。长期以来，人们对咖啡因健康功能的研究一直未能阐明其功效的靶点，使咖啡健康功效的分子机理研究进展缓慢。研究团队通过分子互作技术研究发现，咖啡因能够直接与细胞线粒体中一个重要的去乙酰化修饰酶（SIRT3）结合，阐明了咖啡因直接与细胞线粒体中SIRT3结合，增强其生物学活性，能够活化过氧化物歧化酶2（SOD2），清除紫外线照射时线粒体中产生的氧化自由基效应的分子机制。研究结果表明，咖啡因有效改善了紫外线辐射诱导的皮肤损伤，为咖啡因应用于防紫外线护肤用品开发提供了科学依据。研究还发现，咖啡因能够与细胞内葡萄糖代谢相关的酶（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，G6PDH）结合，抑制其生物酶活性，调节氧化还原稳态，从而抑制肾癌的发展，揭示了咖啡因抑制肾癌的分子机制。该研究结果为咖啡因用于肾癌的防治提供了线索。

创新性成果、科学意义和水平：发现了咖啡因出乎意料的新靶点，是咖啡因研究令人兴奋的重要突破。以上研究工作在国际期刊《Frontiers in Cell and Developmental Biology》（《发育与细胞生物学前沿》）上以“Caffeine Targets SIRT3 to Enhance SOD2 Activity in Mitochondria”(Front. Cell and Dev. Biol.2020, 8:822)和“Caffeine Targets G6PDH to Disrupt Redox Homeostasis and Inhibit Renal Cell Carcinoma Proliferation.”(Front. Cell and Dev. Biol. 2020, 8: 556162)为题连发2篇咖啡因新靶点研究论文，报道了团队发现的咖啡因健康功能的两个新靶点，揭示了咖啡抗氧化和抗肾癌的分子机理，该研究为咖啡因的广泛应用提供了科学依据。

团队共承担国家重点研发、国家基金、云南省科技重大专项、云南省基金重点项目、面上项目等国家、省级项目35项，研发经费合同金额6000余万元，到位研发经费4002.2万元，研究成果在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., Int. Ed., Nat.Commun., Mol. Plant., Org. Lett.和Chem. Commun.等杂志发表高水平研究论文116篇，主编/参编出版专著5部，3位团队核心成员参与省科技进步特等奖1项、省科技进步一等奖1项，授权专利9项，其中国家发明专利4项。研究中产出一系列的研究成果，在相关的领域产生了重要影响，在社会、经济发展中发挥了重要作用。

盛军教授科研团队开发一种新型的靶向EGFR的小分子荧光探针用于细胞和动物活体成像

人表皮生长因子受体（EGFR），是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体，与配体结合后激活胞内区的酪氨酸激酶区域，从而启动细胞核内相关基因表达。EGFR过表达会激活下游信号通路，导致细胞过度生长并且具有侵袭性，在乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌等，EGFR都会过表达，有些表达率甚至高达90%，是目前抗肿瘤药物研发的热门靶点。对EGFR蛋白可视化研究，尤其是荧光可视化研究是一项非常必要和极具挑战性的工作。

设计了两种靶向EGFR小分子荧光分子探针，在第一代激酶抑制剂吉非替尼的基础上，引入了两种环境敏感型的荧光基团DNS和NBS取代吉非替尼的吗啉环片段、改变碳脂肪链连接臂的长度（2C-5C）等合成符合设计目的的化学分子。采用MTT法检测分子对过表达EGFR细胞系A431的抗增殖活性，筛选出了与吉非替尼活性相当的探针分子GN3，并用WB验证了其抑制EGFR磷酸化的能力。同时，对探针GN3与EGFR蛋白进行分子对接模拟，发现GN3能够很好的与EGFR蛋白的ATP结合口袋结合。并用Biacore S200 SPR系统评估了它们的实时相互作用，结果显示GN3与EGFR有显著亲和能力。

在细胞和动物活体中的性能测试：发现GN3是一种具有明显切换机制的荧光配体，可以特异性地对EGFR高表达水平的细胞做出荧光响应；在动物体内对wt-Ba/f3肿瘤能有效识别，具有很好的体内肿瘤靶向成像能力。

该论文以我院普洱茶学教育部重点实验室在读博士王丽霞为第一作者，在读博士孙秀丽和已毕业硕士王泽昊参与研究工作。我院盛军教授、王宣军教授、字成庭教授为共同通讯作者。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105585

盛军科研团队发现三七皂苷治疗动脉粥样硬化分子靶点

三七是著名的中药材品种，为五加科人参属植物三七的干燥根及根茎，别名开化田七、人参三七、金不换、南国神草等，三七的花和茎叶也是被列入新资源食品原料，是典型的具有功能导向的食药同源类食品。三七、人参等中药材和食用植物被广泛用于治疗动脉粥样硬化(AS)。AS是心脑血管疾病的主要病理基础，严重威胁着人类的健康和生活质量，而低密度脂蛋白(LDL)是AS的主要致病因素。现有药效学研究表明，三七及其提取物具有抗疲劳、抗动脉粥样硬化、抗炎、以及抗肿瘤、镇痛等多种效用，目前国内使用三七作为配方的中药超过了1000种。但长期以来三七功效的作用受体靶点和分子机理一直没有得到确认，限制了三七药用价值的深入研究和精准应用。

盛军教授团队经过5年的聚焦攻关，针对三七中主要功能成分三七皂苷化学结构特点，首次发现了三七功效的主要成分——三七皂苷S型苷元原人参二醇（PPD）能够与低密度蛋白受体LDLR结合，并在结合LDLR后阻断血液中PCSK9（PCSK9是枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，一种肝源性血液可溶蛋白，与LDLR结合后引发LDLR的降解）与LDLR的结合，从而抑制了PCSK9引发的LDLR降解，促进了肝脏对低密度脂蛋白LDL的摄取，降低了血液中的低密度脂蛋白，缓解了高脂饮食引起的肝脏脂肪积累，进而发挥对动脉粥样硬化的预防和治疗作用。在3个月的三七皂苷干预治疗后，高脂饮食小鼠的动脉粥样硬化显著减轻，肝脏脂肪堆积也明显降低。这是国际上首次发现三七皂苷的受体靶点和作用机制，为开发精准治疗的三七一类新药提供了科学依据。

确定三七皂苷缓解动脉粥样硬化分子靶点研究成果发表在2022年5月最新的《Food & Function》(IF=5.396)上，黄业伟副教授和张蒙博士为论文第一作者，盛军教授和王宣军教授为通讯作者。

文章链接：https://doi.org/10.1039/d2fo00392a