本站消息 近日，我校杨生超教授团队在Plant Communications（IF: 10.5）在线发表了题为“Biosynthetic pathway of prescription cucurbitacin IIa and high-level production of key triterpenoid intermediates in engineered yeast and tobacco”的研究论文，该研究阐明了处方成分雪胆甲素的生物合成途径，并首次构建了基于葡萄糖碳源的工程酿酒酵母菌株和烟草底盘，可从头合成关键葫芦素三萜中间体。
雪胆甲素作为典型的葫芦素F类化合物，是非甾体抗炎药雪胆甲素片和雪胆甲素胶囊的主要成分，主要分布于雪胆属植物中。葫芦素是一类特殊的四环三萜类化合物，广泛存在于葫芦科和其他科植物中，以其苦味和活性而著称。根据骨架氧化基团，葫芦素分为十二类（A-T），其骨架种类和氧化位点较多，具有广泛的生物活性。目前制药领域主要依靠提取获得葫芦素类药物，但其在植物中含量较低和提取程序复杂，无法满足市场供给。虽然合成生物学为高价值天然药物生产提供了有效的解决办法，但葫芦素的异源生物合成目前仅限于前体Cuol，验证参与合成骨架和下游的大量CYP仍然较为困难。因此，建立高产葫芦素中间体的烟草瞬时表达系统和酵母底盘对于推进代谢工程工作至关重要。
该研究对隶属葫芦科（Cucurbitaceae）雪胆属Hemsleya Cogn.植物，富含其C3位为α-OH典型特征的葫芦素F类分子进行了生物合成途径解析。发现Culla在Hemsleya chinensis的块茎中特异性积累。植物中的生物合成途径基因通常是共同调控和组织特异性共表达，通过代谢组学和转录组学相结合的分析将其编译成共表达的功能单元。进一步开展了基因共表达分析和基因功能鉴定试验。最终，通过大肠表达蛋白的体外酶活性以及在酿酒酵母和本氏烟草中异源表达，验证了葫芦素IIa生物合成的两种角鲨烯环氧酶（HcSE1-2）、六个OSC基因（HcOSC1-6）、两个CYP450（HcCYP87D20和HcCYP81Q59）和1个酰基转移酶（HcAT1）的功能。其中HcOSC6负责形成葫芦素骨架葫芦二烯醇后，HcCYP87D20负责骨架上C11位上羰基化和C20位上的羟基化修饰，生成葫芦素中间体11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol；最后一步是HcAT1负责葫芦素IIb的C25位羟基上的乙酰化修饰，形成葫芦素IIa（Culla）。作者讨论中展望HcCYP87D20是葫芦素骨架氧化修饰的第一步优势酶基因，可能需要进一步研究探索CYP和氧化还原酶表达的不同组合以鉴定功能基因，比如HcCYP81Q59等。
尽管初步阐明Culla的生物合成途径，由于葫芦素的高度氧化修饰特点，其关键修饰基团，如C-3羰基或者 C-3 α-OH （CuF）、C-22羰基和C-16 α-OH等的形成机理和相关基因的尚未得到解析，从而严重限制了葫芦素的异源合成的进展。因此，建立高产葫芦素中间体的底盘对于推进完整途径解析和代谢工程工作至关重要。作者通过构建高产葫芦二烯醇(Cuol)酵母底盘细胞Cuol1-1，摇瓶发酵产量达到296.37 mg/L，进一步通过在6 L的生物反应器分批补料发酵，目标产物Cuol可达到787.17 mg/L。同时，利用代谢工程策略，基于前期高产葫芦二烯醇构建方法，首次通过甲羟戊酸途径的模块化工程、筛选最佳CPR氧化还原体系和P450表达水平的优化及氧化效率等策略构建底盘酵母DNCm8703，从葡萄糖高水平从头生产葫芦素中间体，在摇瓶中可产生46.41 mg/L的11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol和126.47mg/L的总葫芦素三萜类化合物。这一系列的工程菌株将为下游基因的功能表征和葫芦素单体合成奠定了基础。
与酵母系统相比，植物系统可能作为萜类化合物生产更理想的宿主。该研究将 HcOSC6 与不同的上游甲羟戊酸途径基因共表达，以确定对Cuol产生的影响。结果表明AstHMG-CoA（tHMGR）还原酶基因可将 Cuol 的产量提高三倍，使Cuol 含量为 4.18 mg/g (dw)，证明与AstHMGR 共表达可以显著增加瞬时植物表达系统中三萜的产量。这项研究还在烟草中瞬时共表达了 HcCYP87D20 与 HcOSC6或者AstHMGR。结果表明，在与 AstHMGR 共表达的瞬时植物表达系统中，11-carbonyl -Cuol 和 11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol的产量均增加了2倍。11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol可能比酵母工程菌株DNcm87-03更容易在烟叶中获得。
综上所述，这项工作揭示了处方葫芦素IIa 生物合成的关键基因，并构建了使用葡萄糖作为碳源的工程酿酒酵母菌株，可从头合成关键葫芦素三萜中间体。这将为快速筛选候选基因和高产药理三萜类化合物的生产提供了低成本、高效的平台。
文章链接：https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(24)00055-5
